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流式细胞仪检测时如何选择荧光素《资讯》

发布时间:2020-08-17 12:47:30 阅读: 来源:落地镜厂家

2018-07-06 17:02:11来源: 贤集网

用流式细胞仪对细胞表面和内部抗原进行检测,除必须相应抗体外,各种荧光素也是必不可少的。那么我们应该怎样去选择合适的荧光素呢?

1、根据流式细胞仪的激光器和检测器选择荧光素

荧光素受到一定波长(激发波长)的激光激发后,其原子核外电子由于吸收了激光的能量,由原本运动于基础态轨道跃迁到激光态轨道上运动,然后当电子由激发态重新回到基态时,释放出能量并发射出一定波长(发射波长)的荧光。因此我们在选择荧光素时,应根据我们自己的细胞仪的激光器能够激发的波长和检测器能够检测的波长来选择荧光素。

例如,ASCADE-BLU需用紫外激光,有紫外激光器时可选择;FITC和PE,PI等激发波长为488nm,只有具备氩光激光器时才能选择。APC,PC5等的激发波长在红光范围,需要发射630nm波长红光的氦-氢激光器。

另外,各荧光素的发射波长也需要考虑。如FITC被激光激发后发射绿光,检测时需用第一光电倍增管PMT1。PE发射橙光,用第二光电倍增管PMT2。PC5,Per CP发射的是深红光,需要PMT3或PMT4。

2、多荧光素组合,尽量选择同一激光激发

当多荧光素组合时,尽量选择同一激光激发,如果不同激发器激发,在实际检测中会因为两激光调节不同,影响荧光素的灵敏度。

例如,单激光三色分析时,因使用单激光激发,所以应选择三种荧光素的激发波长应该一样。其中的两色多用FITC和PE,第三色则应用Per CP,ECD或PC5,因为这些色素的激发光均为488nm的蓝光,可用一种激光器激发。

3、根据荧光素的强度和分子量选择

FITC为小的荧光素分子,其效率,即荧光强度,取决于溶液的pH值。因此,在使用时应注意样本溶液的酸碱度。PE的分子质量较大,为240KD,故可能会对其他大探针产生空间位阻。但PE的化学结构非常稳定,有很高的荧光效率,并易与抗体分子结合。

4、搭配荧光素之间发射光谱重叠应尽量小

每个荧光通道选一种荧光,荧光素可随意搭配,但是应该考虑荧光素之间发射光谱重叠问题,选择试剂组合时要将光谱叠加可能性减到最低。这可能与选择最亮的荧光素的规则是冲突的。如在进行四色分析,经常会将PE-Cy5标记的抗体与APC标记的抗体搭配使用,此搭配需较大幅度地调节两者的颜色补偿。可选用PE-Cy5.5来替代PE-Cy5,颜色补偿只需1%左右。因为Cy5的激发波长与APC的激发波长相近,所以PE-Cy5荧光素中的Cy5,也会被激发APC的第二个激光器(氦氖激光器)所激发,导致PE-Cy5与APC的颜色补偿很难调。相反,PE-Cy5.5中的Cy5.5激发波长为675nm,不能被激发APC的第二个激光器所激发,也就不存在Cy5.5对APC的干扰,颜色补偿也就很小。因此,可能需要牺牲个别的荧光的亮度来避免荧光渗漏以及敏感度丧失。

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